起首，获取亲本和BRAFi耐药性SKMEL28和WM3248细胞。获取A375SM细胞并在弥补10% FBS的DMEM中培育。获取MCF7，MDA-MB231和A172细胞并在弥补10% FBS的DMEM中培育。获取HT29，KM12和A549细胞，并在弥补10% FBS的RPMI1640中培育。获取前，通过Sanger测序证明黑色素瘤细胞系BRAFV600E突变。持续处置2μMPLX4032两个月，发生BRAFi耐药性A375SM细胞。在含有2μMPLX4032的培育基中培育BRAFi耐药性细胞系。Sanger测序证明耐药细胞系具有BRAFV600E突变。常规检测细胞系支原体传染。所有细胞系都储具有液氮中，利用前培育不跨越6个月。

　　研究人员通过测定抗模仿和表达YAP-5SA的A375SM细胞的细胞毒性，研究了YAP激活对PD-1+Melan-A26-35特同性CD8+T细胞免疫应对的影响。表达YAP-5SA的黑色素瘤细胞比模仿细胞更具耐药性，PD-1阻断逆转了表达YAP-5SA的A375SM细胞的T细胞细胞毒性。Melan-A26-35特同性CD8+T细胞与YAP-5SA-表达细胞共培育削减了IFNγ和TNFα的发生，使CD107a表达削减。PD-1阻断能够恢复IFNγ，TNFα和CD107a表达削减。由于YAP-5SA诱导PD-L2和PD-L1表达，研究人员探究了PD-L1和PD-L2能否有助于YAP介导的T细胞抑止。与抗PD-1雷同，PD-L1阻断抗体恢复了T细胞的细胞毒性功能，IFNγ和TNFα发生以及CD107a表达。相反，PD-L2阻断抗体医治并不影响CD8+T细胞抗YAP-5SA表达黑素瘤细胞的细胞毒性和细胞因子发生，这申明PD-L2上调不是YAP介导的T细胞抑止的需要前提。总之，这些成果表白，黑素瘤细胞中YAP活化能够推进细胞毒性T细胞PD-1/PD-L1依赖性逃避。

　　Hippo-YAP信号通路是肿瘤抑止的一个主要信号通路。新证据表白，YAP活化是黑素瘤BRAF抑止剂(BRAFi)的主要耐药机制，YAP参与抑止抗肿瘤免疫应对。然而，YAP活性对CTL免疫应对的潜在间接影响仍是一个未知范畴。

　　YAP次要通过与TEAD家族转录因子彼此感化来推进靶基因转录。在TEAD连系位点引入突变能够显著抑止PD-L1上调。此外，使用维替泊芬处置YAP-5SA表达细胞可削减PD-L1 mRNA和概况表达。因而，完整的YAP-TEAD彼此感化是上调PD-L1转录(通过YAP活性)的需要要素。其次，研究人员通过回首公开可用的ChIP-seq数据，在潜在的PD-L1基因加强子区域探究了YAP-TEAD连系位点。他们在PD-L1转录起始位点的13-kb上游发觉了可能供给YAP-TEAD连系位点的一个TEAD4连系窄峰。为确认YAP与这个区域连系，研究人员进行了ChIP阐发。他们检测到了YAP-5SA与13kb上游区域特同性连系活性。为验证通过该候选加强子区域，YAP驱动的PD-L1转录激活，研究人员将13kb上游序列(800bp片段)克隆到具有最小启动子的荧光素酶载体中。加强子序列驱动的萤光素酶活性在表达YAP-5SA的HEK293T细胞中显著高于模仿转染的HEK293T细胞。这些成果表白，与13kb上游加强子连系的YAP-TEAD间接诱导PD-L1转录。

　　近年来，通过单抗阻断免疫查抄点受体PD-1的医治体例使晚期黑色素瘤患者表示出了显著的临床反映。癌细胞概况PD-L1非常表达是很多肿瘤逃避抗肿瘤免疫应对的主要机制，PD-L1表达是免疫查抄点抑止剂无效反映的预测性生物标记物。新研究表白，BRAFi耐药性黑素瘤细胞以PD-L1依赖体例，通过激活YAP，逃避CD8+T细胞免疫应对。

　　为验证YAP介导的PD-L1表达的临床意义，研究人员探究了人类黑素瘤肿瘤样品中YAP活性与PD-L1表达之间的关系。起首，他们阐发了来自TCGA数据库的472个黑素瘤肿瘤的RNA-seq数据，按照基因组变异阐发(GSVA)计较的YAP信号富集分数对肿瘤进行分层。成果表白，具有高YAP富集评分的肿瘤具有显著更高的PD-L1表达。别的，他们对来自65名黑素瘤患者肿瘤标本的YAP和PD-L1进行了免疫组织化学染色。如预期，相较于细胞质YAP染色(低YAP活性)的肿瘤，核或核浆YAP染色(高YAP活性)的肿瘤具有显著更高的PD-L1表达。他们还切磋了BRAFi耐药性黑素瘤既往发布数据中YAP和PD-L1之间的联系。Hugo等人全面阐发了BRAFi / MEKi疗法(GSE65185)前后收集的配对黑素瘤样品。他们在某些耐药肿瘤中发觉了YAP信号激活。PD-L1表达与预处置肿瘤中的IFNγ表达相关。然而，在获得耐药性后，这种相关性削弱，这表白IFNγ以外的因子在节制BRAFi / MEKi耐药性肿瘤中PD-L1表达中起环节感化。YAP信号富集的BRAFi / MEKi耐药性肿瘤亚组中PD-L1也高度上调。总之，这些数据供给了人黑素瘤肿瘤中YAP介导的PD-L1上调的体内证据。

　　研究人员还检测了BRAFi(威罗菲尼)耐药性黑色素瘤细胞中的PD-L1 mRNA和卵白质表达。相较于亲本细胞，BRAFi耐药性SKMEL28, WM3248和A375SM细胞更多地表达PD-L1 mRNA和细胞概况卵白。RNAi介导的YAP及其旁系同源TAZ敲低抑止了BRAFi耐药性细胞中的PD-L1转录和细胞概况表达，这表白YAP/TAZ活性加强与PD-L1表达添加相关。微阵列数据(GSE68599)比力了亲本和BRAFi耐药性黑素瘤细胞以及YAP/TAZ耗竭的耐药细胞，成果证明免疫查抄点配体中耐药细胞PD-L1上调以及YAP/TAZ敲低后PD-L1表达削减。总之，这些成果表白YAP活化上调了黑素瘤细胞上的PD-L1表达。

　　为研究YAP激活对免疫查抄点通路的影响，研究人员起首查抄了表达构成型活性YAP的黑色素瘤细胞的T细胞共抑止/共刺激配体(PD-L2，B7-1，B7-2，半乳糖凝固素9和CD155)。研究人员成立了具有FLAG标识表记标帜的YAP-5SA载体的BRAFV600E突变型黑素瘤细胞系(SKMEL28, WM3248和A375SM)。既往研究表白，通过Hippo通路激酶LATS1和LATS2阻遏YAP抑止性磷酸化，5SA突变会惹起YAP构成型审定位和转录激活。留意，相较于亲代细胞，表达YAP-5SA的黑色素瘤细胞系表示出更普遍的PD-L1和PD-L2概况表达。别的，YAP-5SA(而非野生型YAP)过表达添加了三种黑色素瘤细胞系中PD-L1 mRNA表达以及其概况卵白质表达。这些成果表白，YAP激活诱导了黑素瘤细胞中的PD-L1表达。研究人员还察看到乳腺癌(MCF7，MDA-MB231)，NSCLC(A549)，结肠癌(HT29)和成胶质细胞瘤(A172)细胞中YAP-5SA诱导的PD-L1上调。然而，YAP-5SA表达并未光鲜明显添加KM12结肠癌细胞中的PD-L1程度，这表白YAP介导的PD-L1诱导依赖于细胞布景。

　　PD-1阻断使与表达YAP-5SA的黑素瘤细胞共培育的CD8+T细胞的细胞毒性功能不完全修复。一种可能是PD- /PD-L1彼此感化可能不会被抗PD-1完全阻断;另一种可能是YAP可能惹起独立于PD-L1的免疫逃避机制。与YAP-5SA-表达黑素瘤细胞共培育后，非耗竭PD-1阳性Melan-A26-35特同性CD8+T细胞的细胞毒性功能和细胞因子发生受抑止，该抑止不受PD-1阻断的影响。这表白，YAP能够以PD-L1依赖性和PD-L1独立的体例，推进黑色素瘤细胞的免疫逃避。

　　YAP激活推进BRAFi耐药性和PD-L1表达，YAP是BRAFi耐药性和免疫逃逸过程之间的分子桥梁。因而，研究人员研究了BRAFi耐药性黑素瘤细胞中YAP活化对肿瘤抗原特同性CD8+T细胞效应子功能的影响，使用表达HLA-A2的A375SM细胞进行细胞毒性测定。YAP-5SA表达和BRAFi耐药性均不影响HLA-A2表达。研究人员成立了HLA-A2限制性Melan-A肽特同性CD8+T细胞系(来自HLA-A2+健康供体的外周血单核细胞)。所得的细胞培育物含有95.9%的Melan-A26-35特同性CD8+T细胞并表示出最低程度的PD-1表达。为模仿肿瘤微情况中的T细胞耗尽，研究人员使用照顾YAP-5SA的Melan-A26-35肽脉冲PD-L1+A375SM黑素瘤细胞培育T细胞系。培育7天后，研究人员察看到T细胞上PD-1表达的强烈诱导。然后，他们查抄了PD-1+Melan-A26-35特同性CD8+T细胞抗同源抗原脉冲亲本和BRAFi耐药性A375SM细胞的细胞毒性。CD8+T细胞成功杀死了亲代A375SM细胞，跟着效应子/靶标比率的添加，细胞毒性成比例添加。BRAFi耐药性A375SM细胞表示出对CD8+T细胞细胞毒性的抵当性，它能够通过阻断PD-1而恢复，但抗PD-1抗体不影响亲代细胞的杀伤力。他们还研究了与黑素瘤细胞共培育的T细胞的其他效应器功能。成果表白，与BRAFi耐药性黑素瘤细胞共培育的CD8+T细胞中，IFNγ，TNFα发生显著削减，CD107a表达显著降低。这证明了BRAFi耐药性黑素瘤细胞中T细胞耗竭。与细胞毒性恢复分歧，抗PD-1抗体医治恢复了T细胞效应功能。这些成果表白，BRAFi耐药性黑素瘤细胞通过PD-1依赖性CD8+T细胞耗竭诱导免疫逃逸。

　　我们晓得，EGFR，AKT和MAPK致癌通路激活能够诱导癌细胞上PD-L1表达。为检测这些通路能否参与YAP介导的PD-L1表达，研究人员使用埃罗替尼(EGFR抑止剂)，MK-2206(AKT抑止剂)或PD0325901(MEK抑止剂)处置表达YAP-5SA的黑素瘤细胞并检测PD-L1表达。成果表白，很大程度上，PD-L1表达升高不受抑止致癌信号传导通路的影响，这申明YAP介导的PD-L1表达不需要这些通路。在耽误的T细胞免疫应对期间，IFN-γ表露也诱导PD-L1表达，激发顺应性免疫逃避，因而研究人员检测了YAP能否参与IFNγ介导的PD-L1上调。短期(48小时)和持久(7天)IFNγ处置不克不及推进YAP审定位。此外，YAP/TAZ耗损不影响IFNγ诱导的PD-L1。研究人员还检测了YAP激活对JAK / STAT通路(IFNγ信号传导的次要下流效应子)的影响。表达模仿物和表达YAP-5SA的黑素瘤细胞中均无磷酸化STAT1活性，但IFNγ处置的模仿A375SM细胞显示出高磷酸化STAT1。这些成果申明IFNγ通路和YAP独立调理PD-L1表达。