虽然采用哺乳系统出产重组卵白是近十年间的趋向，可是还有其他表达系统也可用于重组卵白出产。因为这些生物细胞贫乏所需的相关酶机制，不适合出产含有糖链的卵白，因而其常用于不含糖基化的卵白出产。细菌表达系统具有快速增殖、高表达卵白的劣势，然而卵白往往会构成聚体，而且因为分子伴侣卵白的缺失必需通过萃取才能获得。一些贸易化的卵白如天冬酰胺酶、胶原酶，其本身不含糖链，常用细菌表达系统出产。酵母表达系统具有细菌同样的劣势，增殖速度快、卵白表达高，但这些卵白往往具有高甘露糖糖型，对人体可能具有免疫原性且疗效不高，例如奥克纤溶酶。

　　在制药企业中，糖卵白的出产在细胞的瞬转或稳转基因表达系统中都获得实现。当要求快速和经济时，瞬转表达仍然是卵白出产的首选，其跳过了冗长的筛选步调，只需将含有方针基因的质粒导入细胞中便可，速度更快，更具效率。卵白合成速度依赖于很多要素，如转染时的无效率、转染试剂的细胞毒性以及培育时的补料策略等，因而瞬转虽然没有稳转的卵白表达程度高，但对于大都环境下瞬转更为无效。现实上，因为瞬转时的质粒是处于染色体外面的，细胞割裂时容易形成质粒丢失，进而限制了卵白的产量。目前为止，通过病毒质粒进行的基因医治次要仍是由瞬转完成。当进行大规模的糖卵白出产时，不变的基因表达系统是更好的选择。为提高卵白产量、工艺耐受性及削减细胞培育时间，在这些系统中曾经做了多方面的勤奋及优化。

　　为提高卵白合成速度及筛选效率，近年来成长了良多筛选系统。在不变表达系统中，将方针cDNA整合在质粒时往往会再插手一段基因标识表记标帜物，使其在筛选过程中带有必然的劣势。质粒的拷贝数和整合到宿主基因中的位点是不变基因表达系统中的环节要素。在生物制药中有两种常见的筛选标记，谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)和二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase，DHFR)。GS筛选系统最后是由Celltech (Lonza)开辟的，通过由重组GS基因建立的谷氨酰胺养分缺陷互补株获得。因为NS0和Sp2/0只表达少量的内源性GS，因而只需将谷氨酰胺从培育基中移除便可满足筛选前提。而在CHO细胞系中，为添加GS筛选系统的筛选压力还需向培育基中添加蛋氨酸亚砜胺(methionine sulfoximine，MSX，谷氨酸雷同物)，MSX能够抑止内源性谷氨酰胺活性。为添加此筛选系统的机能，Eli Lilly曾经在CHO细胞系中开辟出了谷氨酰胺合成酶基因敲除细胞系(KO)。同样，为成立DHFR筛选系统在CHO细胞中也建立了DHFR缺陷株。将重组DHFR基因整合到质粒中，将所建立的细胞株在不含核苷酸且DHFR酶活抑止剂(氨甲蝶呤)具有的培育基中进行培育，跟着氨甲蝶呤的浓度培育，方针基因的拷贝数也在不竭添加。除去上面提到的两个筛选系统，还有其他筛选系统如OSCAR，但目前为止只要DHFR和GS筛选系统被用于大规模出产中。

　　在过去几年中，生物制药行业已转向由哺乳动物细胞表达系统进行生物制剂的出产。目前为止所有哺乳动物细胞表达系统中，CHO细胞使用最普遍，占领了70%的重组卵白出产，且大多卵白为单抗。本文对出产糖卵白用的哺乳细胞细胞系进行了引见，并概述了CHO细胞系的筛选系统和基因表达系统。

　　某些顺式感化表观遗传调控组件也能够用于提高细胞的产卵白能力及不变性，这些组件通过重塑核染色质情况可不变方针基因转录活性。此中使用最多的一个顺式感化组件为MAR，为真核基因特有的顺式感化组件，由非组卵白的纤维卵白和大分子量的RNA构成三维网架系统。有研究表白，重组卵白表达系统中具有MAR组件时能够较着提高表达程度，但也有学者指出MAR对序列具有要求，只要在特定序列中才会表示出感化。其他遗传调控组件还有UCOEs和STAR，已有研究使用UCOEs降低分歧克隆间的表达差同性，关于STAR的使用还没有报道过。

　　现阶段一些人类细胞系还用于临床前研究和/或重组糖卵白出产的临床开辟阶段，如PER.C6细胞，这些细胞即便不消扩增相关基因也可获得高产量卵白。MOR103和CL184都是由PER.C6出产的医治卵白，目前均已开展临床1/2研究。由HEK293S细胞和人类B细胞融合获得的HKB-11细胞，展示了高浓度的卵白出产及α2,3和α2,6-唾液酸毗连。别的两种细胞系，CAP和HuH-7细胞出产的卵白目前正处于临床试验中，而且表示出与人类卵白类似的糖基化程度。

　　对于动物和虫豸细胞，两者都能够出产含有复杂糖基化的卵白，但其类型布局与人类相差较大。现实上，动物表达以α1,3-果糖和β1,2-木糖为焦点的糖链，完全与人类的分歧，且可能会有免疫原性。虫豸细胞出产的N-糖型不是高甘露糖型就是寡甘糖糖型，动物和虫豸细胞的糖基化程度中都贫乏唾液酸化。在动物和虫豸细胞中也有采用糖基化基因工程对其进行革新而出产卵白的。2012年，FDA核准首个由动物细胞出产的医治性重组卵白taliglucerase alfa。在虫豸系统中核准通过的医治性卵白有人类乳头瘤病毒疫苗、前列腺癌疫苗和流感疫苗。比来，一些医治性卵白在转基因动物中也获得了。和其他哺乳动物表达系同一样，转基因动物表达卵白的糖基化布局与人类也有些分歧。市场中首个转基因动物出产的医治卵白是抗血栓药物重组人抗凝血酶Ⅲ，是从转基因羊奶中获得的。之后又有两种卵白获批，别离是从转基因兔奶中获得的重组C1-Esterase抑止剂和转基因鸡蛋中获得的重组人源化溶酶体酸性脂肪酶。

　　有一种出产人源化糖卵白的方式就是采用人类细胞系进行卵白出产，能够担保的是，即便不是抱负的糖卵白类型，至多不会惹起免疫反映。现阶段使用最多的别离是来自人胚胎肾脏和纤维肉瘤的HEK293和HT-1080细胞，Xigris就是由HEK293出产的，同时也是第一个由人类细胞系合成的被FDA和EMA核准的卵白。在HT-1080细胞中也有四种卵白(Agalsidase alfa, Epoetin delta, Idursulfase和Velaglucerase alfa)的出产获得FDA或EMA核准，虽然这些产物因为贸易要素撤出市场。与HT-1080细胞出产的Velaglucerase alfa比拟，CHO细胞的具有雷同的糖基化表示，同时两者的体外活性、不变性和效能都具有可比性。2014年利用人类细胞系出产医治性的卵白中有良多获得FDA或EMA核准，例如用于防止血友病A和B型流血爆发的rFVIIIFc和rFIXFc。与CHO细胞系比拟，在HEK293细胞系中表达的这些卵白具有更高程度的酪氨酸硫酸化和谷氨酸γ羧化，而且不会具有Neu5Gc和α-gal糖基化。

　　还有一些使用较少的基因东西，如哺乳动物人造染色体表达手艺(ACE)。这种微型基因组在细胞内能够自我节制的进行表达，其基因序列可按照需要进行定制并表达，而且使用于CHO中也获得了可观的卵白表达。在CHO细胞的补料分批培育中对ACE和随机质粒整合系统进行比力，发觉细胞表示及不变性都具有可比性。此外，转座子酶系统也可等闲的将方针基因导入到宿主基因中，如从鳞翅目虫豸中纯化获得的转座子酶PiggyBac，其已在CHO细胞中获得了提高产量的证据。

　　鼠科骨髓瘤细胞(NS0和Sp2/0)，来历于不再合成本源免疫球卵白的肿瘤细胞，也可用于出产贸易用单抗如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕利珠单抗(Palivizumab)。2015年，FDA核准了三种由鼠细胞出产的单抗Dinutuximab、Necitumumab和Elotuzumab，别离用于医治分歧的癌症。别的，鼠细胞表达的Neu5Gc和α-gal糖基化程度比苍鼠细胞要高，因而会添加免疫原性的风险。

　　CHO细胞普遍用于糖卵白的出产，是由其浩繁的长处决定的，如卵白出产速度高、适于大规模工业悬浮培育、可顺应各类无血清和化学限制培育基。此外，CHO细胞出产的重组糖卵白的糖链与人类本身的类似度高，其在人体内具有更好的兼容性和生物活性。别的，因为很多进入CHO细胞的病毒基因均不会表达，对于人类病毒传染CHO细胞表示出很强的抵当性，从而可使卵白被病毒传染的比率降至最低，因而能够降低生物平安风险。别的，在CHO细胞中还开辟了分歧的基因扩增系统，可获得较高的卵白产量。近年来FDA和欧盟核准的单抗药物中，跨越一半的都是由CHO细胞出产的。

　　少小仓鼠肾细胞(BHK)常用于疫苗的出产，目前只要两种重组糖卵白是用BHK细胞出产的，凝血因子VIIa和VIII。这些大分子卵白因为其大量的糖基化和硫酸化程度，对于BHK细胞来说是很有挑战的。

　　第二代基因东西中，则采用的分歧品种的内切酶，如锌指核糖核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9。这些内切酶能够诱导宿主DNA特定位点的双链断开，从而推进质粒通过非同源结尾毗连进行整合或同源的间接修复。ZFN和TALEN手艺都能在核酸酶效应区域添加特定的DNA序列，因而其能够开辟出一种具有高特同性及同源性的DNA重组序列。因为基因序列中包含浩繁的反复序列及高度同源DNA序列，为添加内切酶的特同性及削减脱靶效应，一种基于卵白的基因编纂手艺得以使用，CRISPR/Cas9。其是由Cas9卵白、tracrRNA和crRNA构成的，而且是RNA指导的基因编纂，这项手艺目前已在CHO细胞使用于削减分歧克隆间的卵白产量差同性。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9手艺可用于指定基因的敲除，如GS和DHFR基因，ZFN即是此中使用最成功的手艺之一。虽然这些手艺在指定基因敲除中劣势较着，但仍是会有挑战，其一对宿主基因中的不变及高表达热点简直认。还应留意的是，单次的基因敲除并不克不及处理所有的问题，对于某些卵白还可能需要进行其他的质量调整，如折叠程度、糖基化，这些也能够基因编纂实现。

　　虽然CHO细胞在糖卵白出产中具有很多长处，但对于某些类型的人类卵白糖基化其还不克不及催化表达，如α-2,6-唾液酸化和α-1,3/4-岩藻糖化。然而，对于一些人类不表达的糖基化CHO细胞却表达，如羟乙酸基神经氨酸(Neu5Gc)和半乳糖-α1,3-半乳糖(α-gal)，即便两者的含量都不会跨越2%，但还可能具有免疫原性。即便通过代谢工程进行改善后，CHO细胞对于γ-羧酸类重组卵白如凝血因子的出产还有一些限制。

　　上面提到的筛选系统都能够达到我们的目标，可是其包含方针基因的质粒是随机的整合在宿主基因中的，这种随机的整合不只会惹起细胞群的不分歧性，并且分歧细胞株的卵白表达量也会有很大区别。这种转基因很可能导入到异染色质区域，从而导致基因表达程度很低，而要从大量的细胞池中筛选出将质粒整合到核染色质区域的罕见细胞株将是一项繁冗的工作，因而合适的基因编纂东西将会大大添加效率。目前，已有多种分子和细胞生物东西针对特定的基因位点进行整合，这将协助生物制药公司削减基因整合的随机性及对高表达细胞株的预测。虽然与随机整合策略比拟，分手出高产不变的细胞系需要更多的工作，但这仍然是一个更具吸引的方式，由于其能够节制和预测子代克隆的表达程度。当方针基因与筛选标识表记标帜物在统一质粒上整合到核染色质区域时，方针基因及标识表记标帜物的表达添加的几率城市添加。

　　第一代基因东西，利用特同性重组酶靶向特定DNA位点进行敲除，有整合酶Cre/Lox和Flp/FRT。重组酶介导的盒式互换手艺(RMCE)因为其能够这点靶向基因嵌入物而备受企业喜好，RMCE操纵重组酶对DNA分歧识别位点突变体的识别差别，通过两次相对独立的重组反映发生一种互换的结果。RMCE手艺提高了工业化不变表达单抗的CHO细胞的建立成功率，缩短了细胞株建立时间。