病毒颗粒同时具有于包装细胞和培育上清中。能够将细胞和培育上清都收集下来以获得最好的收率。

　　2) 将产毒的细胞连同培育基一同收集到一个15ml 的离心管中。收集细胞时，将培育盘倾斜必然角度将细胞刮到培育基中;

　　1.病毒操作时最好利用生物平安柜。若是利用通俗超净工作台操作病毒，请不 要打开排风机。

　　1) 10,000 g 离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。

　　跟着传代的次数添加，AAV-293细胞会呈现发展形态下降、突变等。为了防止此类现象的呈现，我们需要在起头就对细胞进行大量冻存，以包管明验的不变性和持续性。在细胞对数发展期进行冻存，添加细胞苏醒成活率。

　　2) 将样品插手到超速离心管中，用事后配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液将离心管残剩空间填满;

　　4、去掉上清，插手5ml 新颖的完全培育基，混匀沉淀后，转入6 cm 培育皿。

　　1)病毒能够存放于-80℃ 6 个月以上;但若是病毒储存时间跨越 6个月，建议在利用前需要从头测定病毒滴度。

　　3.操作病毒时出格小心不要发生气雾或飞溅。若是操作时超净工作台有病毒污染，请当即用 70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭清洁。接触过病毒的枪头、离心管、培育板、培育液等请用 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡留宿后弃去。

　　当细胞传代次数过多，细胞形态变差时，或者细胞呈现污染变乱时，需要丢弃并对最后冻存的细胞进行苏醒。

　　3) 在 175,000 g 下离心24 小时，以构成密度梯度。按挨次分步收集分歧密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有AAV 颗粒的组分;

　　若是需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，利用 PBS 缓冲液或培育目标细胞无血清培育基(含血清或含双抗不影响病毒传染)。混匀分 装后 4℃保留(请尽量在三天内用完) 分装后利用。

　　6、第二天察看细胞存活率。给细胞换一下培育基。当前每天察看细胞发展环境。

　　5)将病毒装入100 kDa的透析袋，4度透析脱盐留宿。此即为纯化的AAV病毒

　　6) 用 0.45 m 过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。

　　3、细胞计数，将细胞全数晃下，插手 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较鼎力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mLeppendorf管中，插手 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板入彀数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4(得每大格细胞数)，再乘以 10(10 倍稀释)，即为现实 n 万/mL 细胞浓度。

　　收到病毒液后在很短时间内即利用腺相关病毒进行尝试，能够将病毒临时放置于 4℃保留;如需持久保留请放置于-80℃(病毒置于冻存管，并 利用封口膜封口)。

　　2)频频冻畅通领悟降低病毒滴度：每次冻畅通领悟降低病毒滴度10%;因而在病毒利用过程中应尽量避免频频冻融，为避免频频冻融，建议收到病毒后按照每次的 利用量进行分装。

　　注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产物，利用申明参考LipofiterTM仿单。

　　4) 12,000 rpm 离心 2h，弃上清，病毒沉淀用适量的 PBS 溶液消融，待完全消融后 用 0.22um 滤器过滤除菌。

　　1) 预备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37C 水浴;

　　5、将培育皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培育箱中培育。

　　5.如需要离心，应利用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，并且尽 量利用组织培育室内的离心计心情。

　　当细胞发展到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞优良的发展形态。

　　2、插手0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下察看细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，插手新颖培育基吹打混匀，移入离心管中。

　　7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保留，并作记实。保留过程中，要不时苏醒细胞检测细胞存活率，察看细胞形态等。

　　4.用显微镜察看细胞传染环境时应服从以下步调：拧紧培育瓶或盖紧培育板。 用 70%乙醇清理培育瓶外壁后到显微镜处察看摄影。分开显微镜尝试台之前，用70%乙醇清理显微镜尝试台。

　　3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在此中加上1ml 新颖的完全培育基，混匀后离心，1000 rpm/min，5min。

　　将培育AAV-293 细胞T75 瓶中的培育基吸净，插手2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其平均笼盖瓶底，置于37 度培育箱中3-5min，取出，摇晃可发觉细胞于底部离开，将其全数晃下，插手3mL 37 度水浴中预热的10% DMEM，移液枪用10mL 移液管进行吹打，较鼎力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管瞄准培口，小力将培育基打出即可笼盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，插手450ul 10% DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板入彀数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10 倍稀释)，即为现实n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000 万/T75;若第三天转染，铺350-400 万/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培育基。转染当天察看细胞密度，80-90%满即可进行转染。转染前无需换培育基。

　　4) 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37C 水浴中频频转移，冻融四次。每次融解后稍加震动。留意：每次凝固息争冻大要需要十分钟的时间。

　　3、按照具体环境，将细胞分到10cm 培育皿中，每个培育皿补足到10ml 培育基。

　　3) 1000 rpm/min，离心3 分钟，分手细胞和上清，将上清别的存放，细胞用1ml PBS 重悬;

　　建立好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需颠末大量抽提， 浓度大于1ug/ul，A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。保举利用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。

　　2、查看细胞库记实，按照记实从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套，防止被冻伤)，敏捷丢入水浴锅中并快速晃悠，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全